นับเซลล์ยังไง?…ให้แม่นยำ!!

ถ้าคุณเป็นคนหนึ่งที่ทำงานเพาะเลี้ยงเซลล์ในห้องปฏิบัติการ และเมื่อเซลล์ที่คุณเลี้ยงเพิ่มปริมาณมากขึ้น การนับเซลล์ (Cell counting) ก็เป็นหนึ่งในขั้นตอนการทำงานที่คุณต้องพบเจอ ในงานด้านวิทยาศาสตร์สิ่งมีชีวิต (Life Science) เราต้องมีการนับเซลล์เพื่อหาปริมาณของเซลล์ที่เกิดขึ้น ทั้งในงานการเพาะเลี้ยงเซลล์ (cell culture) งานเพื่อการวินิจฉัยและรักษาโรค เช่น การนับเซลล์เม็ดเลือดขาวและเซลล์เม็ดเลือดแดง โดยหน่วยที่นิยมใช้ในการนับเซลล์คือ จำนวนเซลล์ต่อหน่วยปริมาตร หรือความเข้มข้น ยกตัวอย่างเช่น เซลล์จำนวน 5,000 เซลล์ต่อหน่วยมิลลิลิตร

การเพาะเลี้ยงเซลล์ เราจะแบ่งเซลล์ได้เป็น 2 ชนิด คือ

  1. เซลล์เกาะ (adhesion cell) ที่โตกระจายทั่วภาชนะเลี้ยงเซลล์ เมื่อถึงเวลานับเซลล์ เราต้องทำการลอกเซลล์ (detach) ออกจากภาชนะเพาะเลี้ยงเซลล์ โดยใช้น้ำยาเพื่อลอกเซลล์ (Dissociation Solution) เช่น ทริปซิน (Trypsin) ก่อนที่จะเริ่มนับเซลล์
  2. เซลล์แขวนลอย (suspension cell) การเริ่มนับเซลล์ชนิดนี้ไม่จำเป็นต้องมีการลอกเซลล์ออกจากภาชนะ แต่คุณต้องดูดสารละลายเซลล์ที่อยู่ในอาหารเพาะเลี้ยง (cell culture medium) แล้วจึงจะสามารถนำเซลล์ไปนับได้ทันที

ซึ่งการนับเซลล์ จะมี 2 วิธีที่นิยมปฏิบัติกัน คือ การนับเซลล์ด้วยมือและการนับเซลล์แบบอัตโนมัติ

  1. การนับเซลล์ด้วยมือ (manual cell counting): เราจะนับโดยใช้ Hemocytometer หรือ Counting chamber ส่องผ่านกล้องจุลทรรศน์

นับจำนวนของเซลล์บนพื้นที่ของสไลด์ โดยมองผ่านกล้องจุลทรรศน์ จะพบว่ามีกริดอยู่ด้านในแบ่งเป็นช่องกำหนดเป็นพื้นที่ไว้ โดยขอบจะยกสูงขึ้นมาให้วางแผ่นแก้ว (cover slip) เพื่อกำหนดส่วนสูงให้ได้ 0.1 มิลลิเมตร เมื่อนำเซลล์ที่ละลายอยู่ในสารละลายที่อาจผสมหรือไม่ผสมสีย้อมเซลล์ เช่น trypan blue เข้าไปในช่องว่างระหว่างแผ่นแก้วแล้วนับเซลล์บนพื้นที่ตามตารางกริดคูณกับส่วนสูงก็จะทราบจำนวนเซลล์ต่อหนึ่งหน่วยปริมาตร (จำนวนเซลล์ต่อมิลลิลิตร) 

ข้อดี : สามารถย้อมเซลล์ด้วยสีย้อมเช่น trypan blue และเลือกนับได้ว่าเซลล์ไหนเป็นเซลล์เป็นหรือเซลล์ตาย 

ข้อเสีย : การดำเนินการใช้เวลานาน และอาจเกิดข้อผิดพลาดทางสถิติสูงเพราะนับด้วยสายตาของคน ซึ่งส่งผลให้เกิดความผิดพลาดได้ ความแม่นยำน้อย

  1. การนับเซลล์แบบอัตโนมัติ (automated cell counting) : วิธีนี้เราสามารถทำได้ 3 แบบ

2.1. Electrical resistance คือ ทำโดยเจือจางเซลล์ในสารละลายเกลือ (ของเหลวที่นำไฟฟ้า) ที่มีความเข้มข้นเท่ากับความเข้มข้นของเซลล์ (isotonic) และนับเซลล์โดยให้หลักการที่ว่าเมื่อเซลล์เคลื่อนผ่านช่องแคบ (orifice) ของอิเล็คโทรล ให้แค่ครั้งละ 1 เซลล์เท่านั้น เมื่อเซลล์เคลื่อนที่ผ่านจะทำให้เกิดการเพิ่มความต้านทานไฟฟ้าตามปริมาตรของอนุภาค ความต้านทานที่เพิ่มขึ้นก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของความต่างศักย์และจะถูกขยายสัญญาณ และส่งเข้าเครื่องวิเคราะห์ความต่างศักย์ แล้วแปลผลออกมาเป็นขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของเซลล์ที่วัดได้

ข้อดี : นับเซลล์ได้อย่างรวดเร็ว สามารถนับตัวอย่างปริมาณมากได้ภายในเวลาอันสั้น(ใช้เวลานับเซลล์ จำนวน 1,000-4,000 เซลล์ต่อวินาที) ลดความผิดพลาดในการนับ และเลือกนับขนาดของเซลล์ได้

ข้อเสีย : ไม่สามารถแยกเซลล์ที่มีชีวิตอยู่ และเซลล์ที่ตายแล้วได้ อาจมีความผิดพลาดในการนับ กรณีที่เซลล์ที่ไหลผ่านช่องเป็นกลุ่มก้อนของเซลล์ (clump)

2.2 Flow Cytometry เป็นเทคนิคที่ใช้ศึกษาเกี่ยวกับลักษณะทางกายภาพของเซลล์ โดยอาศัยหลักการกระเจิงของแสงเลเซอร์เมื่อตกกระทบเซลล์หรือโมเลกุลของสารเรืองแสงที่ติดกับสารภายในเซลล์ ทำให้สามารถวัดขนาดของเซลล์ ทราบถึงความซับซ้อนขององค์ประกอบภายในเซลล์ ทราบถึงชนิดของเซลล์ ทราบปริมาณสารภายในเซลล์ 

ข้อดี : สามารถใช้งานได้หลากหลายเช่น นับจำนวนเซลล์, วัดขนาดของเซลล์ (gating cell size), การแยกชนิดของเซลล์, สามารถวิเคราะห์ Cluster of differentiation (CD), การวัดขนาดของจีโนม การประมาณจำนวนชุดของโครโมโซมภายในเซลล์พืช

ข้อเสีย : วัดผลช้า, จำเป็นต้อง เตรียมเซลล์ให้เป็น single suspension เพื่อความแม่นยำในการวัด, ราคาเครื่องค่อนข้างสูง

2.3 Image analysis  เตรียมสารละลายเซลล์ที่ย้อมหรือไม่ได้ย้อมด้วย trypan blue จากนั่นนำไปใส่เครื่อง จะถ่ายภาพเซลล์ ขั้นต่อมาเริ่มขั้นตอนการวิเคราะห์ภาพ โดยเริ่มต้นการแยกเซลล์ออกจากภาพพื้นหลัง กำจัดสัญญาณรบกวนออกจากภาพ นับเซลล์เป็นและเซลล์ตาย จากนั่นคำนวณเพื่อทำให้ทราบจำนวนเซลล์ต่อหน่อยปริมาตร บางเครื่องยังสามารถวัดขนาดของเซลล์ (gating cell size ได้)

ข้อดี : หลักการเดียวกับ heamocytometer แต่นับเซลล์ได้รวดเร็วกว่าแม่นยำกว่า ไม่มีความผิดพลาดที่เกิดจากคน (Human error)

ข้อเสีย : อาจต้องใช้น้ำยาพิเศษหรือ counting chamber แบบพิเศษ


สุดท้ายนี้ ไม่ว่าจะวิธีการนับด้วยมือหรือนับแบบอัตโนมัติล้วนมีข้อดีข้อเสีย แต่มันจะดีกว่าไหม หากมีเครื่องนับเซลล์ที่รวมเอาข้อดีของทั้งสองวิธี ได้แก่ เครื่อง Corning® Cell Counter เป็นการนับเซลล์แบบ Image analysis ที่มีข้อดีคือ

  1. นับเซลล์ได้อย่างรวดเร็ว ด้วยระบบ Cloud-based Image Processing
  2. แม่นยำ ด้วยการประมวลผลแบบ Machine Learning ที่มีการพัฒนาอยู่ตลอดเวลา
  3. ประหยัดต้นทุน ใช้งานได้กับ Hemocytometer ทั่วไป ไม่มีค่าใช้จ่ายเพิ่มเติมในการใช้

หากคุณสนใจทดลองสินค้า สามารถติดต่อได้ที่ตัวแทนจำหน่าย ANH ทุกท่าน หรือดูรายละเอียดสินค้าเพิ่มเติม คลิกที่นี่ 

ANH – Your Lab Partner

1