Western blot

ถ้าพูดถึงการศึกษาในเรื่องของโปรตีนนั้น เทคนิคที่สำคัญ ที่เป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลาย ก็คือ Western blot เป็นชื่อวิธีการเพื่อใช้ในการวัด การแสดงออกของโปรตีน  โดยเรียกอีกซื่อหนึ่งว่า Immunoblot เป็นวิธีที่ใช้ติดตามโปรตีนที่เราต้องการศึกษาหรือสนใจอีกทั้งสามารถใช้ดูการแสดงออกในระดับโปรตีน (Protein Expressรion)  และยังสามารตรวจสอบขนาดและความบริสุทธิ์ของโปรตีน (Protein Purification) ซึ่งเราจะสามารถศึกษาโปรตีนที่เราสนใจโดยใช้หลักการของ gel electrophoresis จากนั้นโปรตีนจะถูกย้ายจากแผ่นเจลไปยังแผ่นเมมเบรน ที่เรียกว่า nitrocellulose membrane ขั้นตอนต่อไป การตรวจสอบโปรตีนที่ต้องการโดยใช้หลักการความจำเพาะของแอนติบอดี้หรือที่เรียว่า specific antibody จึงสามารถตรวจสอบโปรตีนที่เราสนใจศึกษาได้ สำหรับขั้นตอนการทำ Western blot ประกอบด้วย 6 ขั้นตอน ดังนี้

  1. ขั้นตอนของการเตรียมตัวอย่างโมเลกุลโปรตีน อาจเป็นตัวอย่างจากเซลล์พืชหรือเซลล์สัตว์ โดยเซลล์จะถูกย่อยด้วย lysis buffer แล้วเก็บส่วนที่เป็นโปรตีนทั้งหมด สำหรับการสกัดโปรตีนนั้นจึงมีความจำเป็นที่จะต้องเติมเอนไซม์ protease inhibitor เพื่อเป็นการป้องกันโปรตีนไม่ให้ถูกทำลาย
  1. การแยกขนาดของโมเลกุลโปรตีน โดยการทำเจลอิเลคโตรฟอเรซีส ( Gel electrophoresis ) หรือที่รู้จักกันดีคือ Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE) เป็นเทคนิคการแยกโมเลกุลของโปรตีนโดยแบ่งออกตามขนาดของโปรตีน (molecular weight) โดยโปรตีนจะอยู่ในบัฟฟอร์ที่เป็นด่าง และเมื่อโมเลกุลของโปรตีนอยู่ กับสาร SDS แล้วนั้นจะทำให้โมเลกุลของโปรตีนกลายเป็นประจุลบ ที่อยู่ภายใต้สนามไฟฟ้าด้วย โดยผ่านตัวกลางคือ Acrylamide gel ซึ่งจะทำให้โมเลกุลโปรตีนที่เป็นประจุลบเคลื่อนที่เข้าหาประจุบวกจึงทำให้โปรตีนจะถูกแยกเป็นตามขนาดน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน ซึ่งการเคลื่อนที่ของโมเลกุลโปรตีนจะเร็วหรือช้าขึ้นอยู่กับ 2 องค์ประกอบคือ น้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน และ ความเป็นรูพรุนของเจล โดยบนแผ่น Acrylamide gel มี 2 ส่วน ด้วยกันคือ stacking gel และ separating gel  ซึ่งส่วน stacking gel จะอยู่ชั้นบนสุด มีความละเอียดของจะเจลต่ำ ทำให้โปรตีนมารอยู่รวม ที่จุดเดียวกัน และส่วน separating gel จะเป็นเจลที่อยู่ชั้นล่างต่อจาก stacking gel โดยเป็นส่วนที่มีรูพรุนของเจลที่มีขนาดเล็กกว่าเป็นส่วนที่ใช้แยกโมเลกุลโปรตีนที่มีขนาดแตกต่างกัน โดยขนาดของโมเลกุลโปรตีนที่ใหญ่กว่าจะเคลื่อนที่ได้ช้ากว่าโมเลกุลที่มีขนาดเล็ก ซึ่งจะเป็นการแยกขนาดของโปรตีนได้
  1. การย้ายโมเลกุลโปรตีนจากแผ่น Acrylamide gel สู่แผ่นเมมเบรน (protein transfer) เป็นการย้ายโมเลกุลโปรตีนที่แยกได้จากขั้นตอนการทำเจลอิเลคโตรฟอเรซีสที่เป็นประจุลบ แล้วย้ายสู่เมมเบรน nitrocellulose  หรือ polyvinylidene fluoride (PVDF) ที่เป็นประจุบวก โดยมีวิธีดังนี้ โดยเรื่มจากการประกบเจลกับแผ่นเมมเบรนเข้าด้วยกัน โดยใช้น้ำยา ทรานเฟอร์บัฟเฟอร์ จากนั้น ย้ายโมเลกุลของโปรตีนลงสู่เมมเบรนด้วยกระแสไฟฟ้าและเข้าสู่การล้างเมมเบรน เพื่อเข้าสู่กระบวนการต่อไป
  1. ขั้นตอนการทำ  Blocking  หลังจากที่ได้ทำการ ย้ายโมเลกุลโปรตีนสู่แผ่นเมมเบรนแล้วนั้น เราจึงมีการบล็อคโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้องออก เพื่อป้องกันการเกิด non-specific และป้องกันไม่ให้โปรตีนอื่นๆเข้ามาจับกับแผ่นเมมเบรน โดยใช้ bovine serum albumin (BSA) หรือ non-fat dry milk  ในสารละลาย Tris Buffer Saline (TBS) ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา  12 ชั่วโมง ซึ่งโปรตีนเหล่านี้จะจับบนที่ว่างของแผ่นเมมเบรน ยกเว้นบริเวณที่มีโมเลกุลโปรตีนจับอยู่แล้ว ซึ่งจะช่วยลดการเกิด false positives ได้
  1. การติดตามผลโมเลกุลของโปรตีน ( immunodetection) ในขั้นตอนการติดตามผลการหาโปรตีนที่สนใจด้วย antibody    โดยหารแช่แผ่น เมมเบรน ที่เป็น primary antibody โดย  Primary antibody เป็น antibody ที่ จำเพาะ ต่อตัวโปรตีนที่เราสนใจศึกษา และ แช่ Secondary antibody เป็น antibody ที่ มีความจำเพาะต่อ primary antibody อีกทีเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง บนเครื่องเขย่า เพื่อใช้ในการ detect ตัวโปรตีนที่เราสนใจ ซึ่ง  secondary antibody อาจมีการลิงค์ด้วยเอนไซม์ หรือ สารเรืองแสง ที่ทำให้มีสี หรือมีการเปล่งแสงเกิดขึ้นออกมา เพื่อใช้ในการตรวจสอบโมเลกุลโปรตีน
  1. การวิเคราะห์ผลโมเลกุลโปรตีนเมมเบรน  (Analysis) หลังการบ่มแผ่นเมมเบรนด้วย primary antibody และ secondary antibody ที่มีความจำเพาะต่อโปรตีนที่เราศึกษาแล้วนั้น ต่อจากนั้นจะเป็นวิธีการติดตามว่าโมเลกุลโปรตีนเป้าหมายนั้น อยู่ที่ตำแหน่งใด ซึ่งการติดต่อวิเคราะห์ผลก็ขึ้นอยู่กับว่าแอนติบอดีที่ใช้ ติดฉลากหรือสารอะไร ซึ่งเราจะสามารถ แบ่งออกได้ดังนี้

– Colorimetric detection เป็นการตรวจสอบและติดตามผลโดยดูจากการเกิดสี ที่เกิดขึ้นบนแผ่นเมมเบรน

– Chemiluminescent detection เป็นการตรวจสอบและติดตามผลโดยดูจากการเรืองแสงด้วยการย่อยของเอนไซม์กับ substrate แล้วเกิดการเรืองแสงออกมา  

– Radioactive detection เป็นการตรวจสอบ และติดตามผล โดย secondary antibody  จะถูกติดฉลากด้วยสารรังสีซึ่งจะเกิดการเปล่งแสงออกมาได้ ด้วยการประกบกับฟิล์มเอกซเรย์

– Fluorescent detection เป็นการตรวจสอบและติดตามผล โดย secondary antibody จะถูกติดฉลากมาด้วยสารเรืองแสง (fluorescent) และจะต้องมีการกระตุ้น การเรืองแสง ในช่วงความยาวคลื่นแสงที่เหมาะสม 

ในปัจจุบันเทคนิคการทำ Western blot จึงเป็นเทคนิคที่สำคัญในการสำหรับการศึกษาเรื่องของโปรตีน ทั้งนี้สามารถนำไปประยุกค์ใช้ได้ตามวัตถุประสงค์ของงานวิจัย  ที่ถือได้ว่าเป็นขั้นตอนพื้นฐานของการตรวจสอบโปรตีนเป้าหมาย

ปัจจุบัน บริษัท เอ.เอ็น.เอช. ไซเอ็นทิฟิค มาร์เก็ตติ้ง จำกัด (ANH) ได้เป็นตัวแทนจำหน่ายผลิตภัณฑ์ทางด้าน Life Science Research ที่มีคุณภาพสูงในกลุ่มของ Buffers and Reagents, Control Antibodies, Control Lysates, Kits, Proteins and Peptides, Primary Antibodies, Secondary Antibodies และ Serum ภายใต้แบรนด์ของ Exalpha Biologicals, INC.  Nordic-Mubio จากประเทศสหรัฐอเมริกา เพื่อตอบโจทย์งานวิจัยทางด้าน immunohistology, immunofluorescence, western blotting, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), flow cytometry and lateral flow assays.

เราพร้อมให้คำปรึกษาโดยทีมงาน Product Specialist ติดต่อสอบถามข้อมูลสินค้าเพิ่มเติมได้ที่ฝ่ายขาย ANH ทั่วประเทศ